Chloroquine 124

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Chloroquino active la voie p53 et induit l'apoptose dans les cellules de gliome humain Ella L. Kim. Robin Wstenberg. Anne Rbsam. Christoph Schmitz-Salue. Gabriele Warnecke. Eva-Maria Bcker. Nadine Pettkus. Daniel Speidel. Veit Rohde. Walter Schulz-Schaeffer. Wolfgang Deppert et Alf Giese Le Translational Research Group neuro-oncologie, Département de neurochirurgie. Georg-Août Université Gttingen, Gttingen. Allemagne (ELKARCS-SE-MBNPVRAG) Université École de médecine du Schleswig-Holstein, Campus Lbeck, Lbeck, Allemagne (RW) Heinrich-Pette-Institut, Hambourg, Allemagne (GWWD) Cell Unité de transformation, Childrens Medical Research Institute, Westmead, New South Wales, Australie (DS) Département de neuropathologie, Georg-Août Université Gttingen, Gttingen, Allemagne (WS-S.) Auteur: Alf Giese, MD, The translationnelle neuro-oncologie Research Group, Département de neurochirurgie. Georg-Août Université Gttingen, Robert-Koch-Strasse 40, 37075 Gttingen. Allemagne (alf. giese med. uni-goettingen. de). Ella Kim, Ph. D., Le Translational Research Group neuro-oncologie, Département de Neurochirurgie, Georg-Août Université Gttingen, Robert-Koch-Strasse 40, 37075 Gttingen, Allemagne (ella. kim med. uni-goettingen. de). Reçu 21 Octobre 2008. Accepté Juin 22, 2009. Résumé glioblastome est la tumeur la plus fréquente du cerveau maligne chez les adultes. Les traitements actuellement disponibles offrent seulement un avantage de survie palliatifs et le besoin de traitements efficaces demeure une priorité urgente. L'activation de la suppression / apoptotique de croissance p53 est une des stratégies prometteuses dans le ciblage des cellules de gliome. Nous montrons que le dérivé quinoléine de la chloroquine active la voie p53 et inhibe la croissance des cellules gliales in vitro et in vivo dans un (U87MG) modèle orthotopique de glioblastome humain de la souris. Induction de l'apoptose est l'un des mécanismes qui sous-tendent les effets de la chloroquine sur la suppression de la croissance des cellules de gliomes et leur viabilité. siRNA médiée par régulation négative de p53 dans de type sauvage, mais pas les cellules de glioblastome p53 mutante altérée sensiblement l'apoptose induite par la chloroquine. En plus de ses effets sur l'activation de p53, de la chloroquine peut également inhiber la croissance des cellules de gliome par des mécanismes indépendants de p53. Nos résultats précisent la base mécaniste qui sous-tend l'effet antinéoplasique de la chloroquine et de révéler son potentiel thérapeutique en tant que complément à la chimiothérapie de gliome. Mots clés glioblastome est la tumeur la plus fréquente du cerveau maligne chez les adultes. En raison de sa radio-notoire et la chimiorésistance, la récurrence des glioblastomes après résection chirurgicale et adjuvant radio-chimiothérapie est inévitable, avec un résultat toujours mortelle. Les traitements actuellement disponibles offrent seulement un avantage de survie palliatifs, ce qui souligne le besoin de traitements efficaces étant une priorité urgente. 1, 2 Ciblage des voies de signalisation intracellulaires impliquées dans la régulation de la croissance et de la viabilité des cellules de gliome est la base moléculaire de plusieurs stratégies thérapeutiques expérimentaux. 3 5 Dans la dernière décennie, l'activation de la voie inhibitrice de croissance de p53 endogène ou la restauration des fonctions de p53 dans les cellules de gliome par l'introduction de facteurs exogènes de type sauvage p53 (wtp53) a été une stratégie intensive explorée pour supprimer la progression de gliome. 6 10 Le suppresseur de tumeur p53 peut puissamment inhiber la croissance cellulaire en induisant un bloc transitoire ou permanente de la prolifération ou l'activation des programmes de mort cellulaire en réponse à différents types de stress cellulaire, ce qui a fourni une raison d'être des thérapies anti-cancer à base de p53. 11 13 En outre, la pertinence des thérapies à base de p53 pour le traitement du gliome est mis en évidence par le fait que p53in contrairement à la plupart des autres tumorsis solide fréquemment muté dans primaire ou de novo glioblastomes (moins de 30 mutations dans le gène TP53, 14 se produisant le plus fréquemment forme de cette tumeur). 15 Un essai de phase I a fourni des preuves convaincantes que le rétablissement des fonctions wtp53 par l'introduction de wtp53 exogène est une approche possible. 7, 10 Cependant, l'expression de wtp53 recombinant dans les cellules de gliome active efficacement les points de contrôle du cycle cellulaire p53-dépendante, mais ne parvient pas à induire l'apoptose, 10 qui, d'un point de vue thérapeutique serait le résultat le plus désiré. 16 Une autre approche pour activer la réponse apoptotique dépendante de p53 est basée sur la capacité de certains agents d'activation de la voie p53 endogène, soit par des agents endommageant l'ADN, soit par les agents qui peuvent stabiliser la protéine p53 dans l'absense des dommages à l'ADN. 17 Dans ce contexte, les effets antitumoraux potentiels de quinoléines ont récemment suscité un intérêt considérable. 18 20 chloroquine est un agent de la membrane pénétrable aminoquinolinic capable d'intercaler dans l'ADN double brin sans causer des dommages physiques à l'ADN. 21 En raison de ses faibles propriétés de base, la chloroquine accumule aussi dans les lysosomes et peut déclencher l'apoptose via l'inhibition de la dégradation des protéines autophagie. 22 26 Largement connu comme un médicament antipaludique et RHUMATOIDE, chloroquine a récemment émergé comme un agent anticancéreux potentiel. Les effets cytotoxiques de la chloroquine ont été démontrées pour les cellules tumorales dérivées de différents types de cancers humains. 22, 23, 27, 28 Les effets de la chloroquine sur les cellules de gliome ont pas été systématiquement étudiés précédemment, mais il existe des preuves empiriques que la chloroquine peut supprimer la progression de gliome clinique par des mécanismes inconnus. 29, 30 Poussé par ces résultats, nous avons examiné les effets de la chloroquine sur la croissance et la viabilité des cellules de gliome in vitro et in vivo. Dans cette étude, nous avons démontré que la chloroquine induit l'apoptose dans les cellules de gliome in vitro et inhibe la croissance des gliomes expérimentaux in vivo. Nos résultats démontrent que les résultats du traitement à la chloroquine à une stabilisation durable de la protéine p53 et induit l'activité transcriptionnelle de p53 dans les cellules de gliome. En outre, nous montrons que la chloroquine présente une activité cytotoxique indépendante de l'activation de la voie p53 dans les cellules avec la fonction de p53 déficientes, bien que de manière moins efficace par rapport aux cellules de gliome avec wtp53 fonctionnelle. Matériaux et méthodes Cellules et anticorps Les lignées cellulaires de gliomes humains utilisés dans l'étude ont été préalablement caractérisées par rapport à leur état fonctionnel p53. 31 Les cellules ont été propagées dans du milieu essentiel minimal (Biochem) supplémenté avec 10 du sérum de veau foetal. Une solution concentrée de chloroquine a été préparé pour chaque expérience en dissolvant le sel de sodium de la chloroquine dans du PBS, stérilisé par filtration et on le dilue à la concentration désirée dans le milieu de culture cellulaire. Les cellules ont été récoltées aux points temporels indiqués après le traitement à la chloroquine, lavées dans du PBS glacé et lysées dans un tampon de lyse cellulaire SDS (50 mmol / L de Tris-HCl, pH 8,0, 150 mmol / L de NaCl et 1 SDS) contenant des inhibiteurs de protéase ( Roche). p53 humaine a été détectée par l'anticorps DO-7 (BD Pharmingen) ou l'anticorps 16G8 reconnaissant la protéine p53 de phosphorylation sensible phosphorylée au niveau Ser15 (Cell Signaling Technology, Inc.). D'autres anticorps utilisés dans l'étude comprenaient ceux contre p21, MDM2, TBP (Santa Cruz Biotechnology), PIG3 (Calbiochem), tubuline (Oncogene), bax (Upstate), ou clivé caspase-3 (Cell Signaling Technology, Inc.). Pour les analyses par transfert de Western, les cellules ont été lysées dans un tampon contenant du SDS de lyse cellulaire additionné d'inhibiteurs de protéase. La concentration en protéine a été déterminée en utilisant le réactif de Bradford (Sigma-Aldrich) et égalisé à l'aide d'un tampon de lyse SDS. Évaluation de la croissance cellulaire, la mort cellulaire et l'apoptose Pour évaluer les effets de la chloroquine sur la croissance cellulaire, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 2,5 10 3 cellules / puits 1 jour avant le traitement. Après 24 heures d'incubation, le traitement par la chloroquine a été déclenchée par addition de chloroquine à la concentration désirée dans le milieu. Après 24 heures d'incubation avec de la chloroquine, les cellules ont été lavées avec du PBS stérile et alimentée par du milieu frais. Les cellules dans 6 puits réplicats ont été fixées avec 3 glutaraldéhyde à intervalles de 24 heures. Au bout de 8 jours consécutifs, les cellules fixées ont été colorées avec du cristal violet ADN de colorant, on l'a lavé avec du PBS, et le colorant a été solubilisé dans un tampon contenant du SDS 1. On a mesuré l'absorbance à 560 nm et représentée graphiquement en fonction du temps d'incubation. Pour évaluer la mort cellulaire, le pourcentage de cellules non viables a été déterminée par le test d'exclusion du bleu trypan. Pour estimer les taux d'apoptose, le pourcentage de cellules apoptotiques a été déterminé en comptant le nombre de cellules positives pour l'examen immunohistochimique de la caspase-3 activée. la fragmentation apoptotique ADN a été évaluée par la détection par immunofluorescence de dUTP TdT médiée étiquetage nick-end (TUNEL) cellules - positif (ApoAlert Fragmentation de l'ADN Assay Kit, Clontech, Takara Bio). Pour évaluer les effets de la chloroquine sur l'intégrité de la fonction de la membrane mitochondriale, des cellules non traitées ou traitées chloroquine ont été colorées avec le colorant cationique fluorescent (5,5,6,6-tétrachloro-1,1,3,3-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodure JC Kit -1 membrane mitochondriale potentielle de détection, Stratagene), ce qui forme des agrégats fluorescents rouges dans les mitochondries des cellules saines, mais pas dans les cellules apoptotiques. 32 Red (excitation 550 nm, émission 600 nm) et vert (excitation 485 nm, émission 535 nm) fluorescence ont été mesurées en utilisant un lecteur de plaque Spectrafluor (TECAN) pour déterminer les rapports de fluorescence rouge / vert. siRNA Transfections et immunofluorescence Les cellules ont été ensemencées sur la couverture glisse dans 24 puits des plaques de cuture de tissu à une densité de 0.61.0 10 5 cellules / mL pendant au moins 24 heures avant la transfection. Les cellules ont été transfectées avec le commerce validé p53 siRNA (TP53 Validé furtif, Invitrogen) ou non spécifique ARNsi crypté (Contrôle négatif furtif, Invitrogen) en utilisant le réactif Lipofectamine 2000 (Invitrogen) selon les recommandations du fournisseur. Pour une coloration par immunofluorescence, les cellules ont été lavées avec du PBS, fixées avec du paraformaldehyde à 4 dans un PBS et perméabilisées dans de l'acétone froide / méthanol (1: 1) le mélange pendant une nuit. Paraformaldéhyde fixes et des cellules perméabilisées ont été lavées dans du PBS BSA dans 0,5, bloqué dans le même tampon et incubées avec un anticorps anticleaved caspase-3 à 4 ° C pendant une nuit. Les cellules lavées ont ensuite été mises à incuber avec Alexa Fluor 555 de chèvre anti-lapin conjugué à l'anticorps (Molecular Probes Inc.) pendant 30 min à température ambiante, suivie de trois lavages au PBS. Enfin, les cellules ont été lavées DAPI. Traitement Chloroquine Orthotopique gliome modèles et toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles pour le bien-être des animaux et à la conduite expérimentale. Pour l'implantation intra-crânienne, les cellules U87MG ont été récoltées à partir de la culture monocouche, lavées deux fois et remises en suspension dans du PBS à une concentration de 0,5 à 10 5 / L. Avant l'implantation, les souris nude (NMRI, Taconic Europe) ont été anesthésiés par une injection peritoneale d'un mélange kétamine / xylazine (120 mg de kétamine et de xylazine 16 mg dans 10 ml de PBS) à 0,1 ml / 10 g de poids corporel. Pour l'implantation, le crâne a été fixé dans un cadre stéréotaxique (systèmes TSE). Les cellules ont été injectées dans les caudato putamen de l'hémisphère droit du cerveau en utilisant les coordonnées stéréotaxiques suivantes en référence au bregma: 1 mm (axe antéro-postérieur), 3 mm (axe latéro) et 2,5 mm (axe vertical). Une dose de seuil de la chloroquine par rapport à la toxicité cérébrale aiguë a été établi par l'injection de 5 L de 0,7, 7,0, 30 ou 70 mM solutions de chloroquine dans la capsule interne de l'hémisphère droit du cerveau de souris kétamine-anesthésiés. À 70 mM, des injections répétées de chloroquine se sont révélés être toxiques, car ils provoquent des crises chez deux souris sur trois. A 30 mM, des injections répétées de chloroquine ont été bien tolérés par tous les animaux receveurs et n'a pas causé de symptômes neurologiques. Par conséquent, une concentration de 30 mM de chloroquine a été utilisé pour le traitement de xénogreffes de gliome intracrâniennes. Au jour 10 après l'implantation, 5 L de PBS ou de la chloroquine a été administré dans le site utilisé pour l'injection des cellules tumorales au moyen d'une injection gras guidée par vis comme décrit 33 pendant 17 jours. Vingt-six jours post-implantation, les animaux ont été sacrifiés après une injection intraperitoneale létale d'un mélange kétamine / xylazine (50 mg de xylazine et 350 mg de kétamine pour 1 kg de poids corporel). Les cerveaux porteurs de tumeurs ont été explantées, fixés dans du formol 4, coupées en coupes coronales, et noyés dans de la paraffine. Un à trois micromètres d'épaisseur des sections ont été placées sur des lames de verre et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. Les zones tumorales plus importantes ont été déterminées par l'examen microscopique des coupes histologiques consécutifs et mesurées en utilisant le logiciel Cell-A-Image (Olympus mous Imaging Systems). sections de paraffine ont été marqués pour l'apoptose par dosage et mitoses TUNEL. Pour le calcul du apoptotique ainsi que les index mitotique, jusqu'à trois sections de la totalité de la tumeur ont été marqués par criblage de la tumeur sur les champs de haute puissance adjacents. Le nombre de apoptoses ou mitoses comptés a été divisé par le nombre de champs à haute puissance (jusqu'à 49) utilisés pour le criblage de la tumeur. Analyses statistiques Chaque point expérimental a été effectué en triple exemplaire par expérience, sauf indication contraire les données indiquées représentent des moyens (SEM). Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le logiciel GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Résultats gliome Chloroquine Inhibe la croissance cellulaire Pour évaluer l'effet de la chloroquine sur la croissance des cellules de gliome, le développement d'un panel de lignées cellulaires de gliome ayant différents statuts de p53 fonctionnelle a été analysée en présence de concentrations croissantes de chloroquine croissante. des lignées cellulaires de gliome U87MG expriment et G120 wtp53. lignes G130 et G44 expriment pas ou p53 tronquée en raison d'aberrations flagrantes chromosomiques (G130) ou une mutation non-sens dans le gène TP53, 31 respectivement. G112 et U251 abritent une mutation TP53 dans le hot-spot codon 273 et expriment p53 mutant transcriptionnellement inactif. Les résultats ont montré que la chloroquine supprime fortement la croissance des cellules de gliome d'une manière dose-dépendante (Fig. 1 A). Bien que l'effet de la chloroquine croissance de suppression a été observée dans toutes les lignées cellulaires testées, les lignées cellulaires avec wtp53 (U87MG et G120) ont semblé plus sensibles à toutes les doses de chloroquine testés par rapport aux lignées cellulaires qui sont nulles pour la p53 (G130), expriment p53 tronquée (G44), ou sur le port inactivant mutations TP53 (U251 et G112). Pour examiner si l'inhibition de la croissance par la chloroquine était une conséquence de la viabilité des cellules touchées, nous avons analysé le pourcentage de cellules non viables dans les cultures non traitées ou chloroquine traitées en utilisant un test d'exclusion au bleu trypan. Les résultats sont résumés sur la Fig. 1 B montrent que la chloroquine affecte la viabilité des cellules de gliome d'une manière dépendante de la dose. Dans la gamme des doses de traitement à la chloroquine testées, la viabilité des cellules était significativement plus faible dans les lignées cellulaires avec wtp53 par rapport aux lignées cellulaires mutp53 exprimant, en accord avec la notion selon laquelle le statut de p53 peut être un facteur important dans la détermination de la sensibilité des cellules de gliome à la chloroquine. Chloroquine inhibe la croissance des cellules de gliome et de la viabilité de la culture. (A) L'évaluation des taux de croissance cellulaire dans les cellules de gliome avec l'état fonctionnel connu de p53. 31 Les cellules ont été traitées avec une plage de concentrations de chloroquine indiquées dans les légendes. (B) L'évaluation des taux de mort cellulaire dans les lignées cellulaires gliome avec wtp53 (panneau de gauche) ou la fonction de p53 déficiente (moyenne et panneaux de droite). Les valeurs représentent la moyenne de 6 répétitions. Apoptose Contribue à Chloroquine-Induced mort dans des cellules de gliome Chloroquine peut induire la mort cellulaire par des mécanismes distincts. Un mécanisme de caspase-indépendante impliquant le ciblage lysosomial a été décrit pour certains types de cellules non tumorigènes. 26 34 En revanche, l'apoptose dépendante de la caspase a été impliquée dans la mort cellulaire induite par la chloroquine dans différents types de cellules tumorales malignes 22, 35 et, dans certains types de neurones. 25 Pour analyser les mécanismes de la mort induite par la chloroquine dans les cellules de gliome, nous avons évalué caractéristiques de la cascade apoptotique, y compris l'activation de la caspase-3 et de la fragmentation de l'ADN génomique. les cellules de gliome ont été traitées avec de la chloroquine à une dose de 30 g / ml, une concentration qui se situe dans la fenêtre de concentrations de chloroquine (2,040 g / ml) a révélé cytotoxique pour l'ensemble des lignées cellulaires de gliome testés (Fig. 1), et qui était suffisante pour induire l'apoptose dans d'autres types de cellules tumorales. 22, 23, 27 Immunofluorescence pour la forme clivée de la caspase-3 a révélé que le traitement à la chloroquine a conduit à l'activation de la caspase-3, qui est indicative d'induction de l'apoptose (fig. 2 ca). Notamment, les cellules chloroquine traités ont généralement montré un changement caractéristique de la morphologie nucléaire (voir encadré, Fig. 2 A), qui, cependant, ne coïncident pas avec la caspase-3 activation. activation induite chloroquinorésistant de la caspase-3 a eu lieu d'une manière dépendante du temps et a été observée après 48 heures de traitement à la chloroquine (fig. 2 A, représentée par la ligne U87MG). Après 96 heures de traitement, la plupart des cellules étaient positives pour la caspase-3 (fig. 2 B) indiquant une réponse apoptotique robuste. L'évaluation de la caspase-3 activation par la chloroquine dans différentes lignées cellulaires est résumée sur la Fig. 2 C. L'activation de la caspase-3 a été considérablement plus profonde dans les cellules de gliome avec wtp53 par rapport à ceux avec le mutant p53 (Fig. 2 C), ce qui suggère une contribution des activités wtp53 à l'apoptose induite par la chloroquine. soutenir davantage l'impact de l'apoptose dans la cytotoxicité de chloroquine-médiée, les cellules de gliome traités par chloroquine ont montré la désintégration de l'ADN génomique comme démontré par TUNEL (Fig. 2 D). L'un des premiers événements induits par la chloroquine dans les cellules de gliome a été une diminution de l'agrégation mitochondriale du colorant fluorescent JC-1 indicative d'une déformation de l'intégrité du potentiel de membrane mitochondriale, qui a précédé l'activation de la caspase-3 et a eu lieu à un moment plus tôt , aussi tôt que 24 heures après le traitement (fig. 2 E). Fait intéressant, une chute du potentiel de la membrane mitochondriale provoquée par la chloroquine est produit avec une efficacité comparable dans les cellules avec ou wtp53 mutp53 (fig. 2 E), indiquant que le dysfonctionnement mitochondrial causé par la chloroquine peut être un effet p53 indépendante. Chloroquino induit une apoptose dans les cellules gliales en culture. (A et B) l'activation dépendante du temps de la caspase-3 par la chloroquine dans les cellules U87MG. Des cellules non traitées ou chloroquine traitées ont été colorées pour la forme clivée de la caspase-3 et contre-par DAPI. L'encart (A) montre la morphologie nucléaire caractéristique des cellules traitées à la chloroquine. (C) Résumé de l'évaluation de l'activation de la caspase-3 dans gliome lignées cellulaires ayant un statut différent de p53. Le pourcentage de cellules positives pour la caspase-3 a été déterminée en comptant un minimum de 500 cellules dans 510 champs microscopiques dans des essais répétés de 3 pour chaque condition. (D) L'évaluation de l'apoptose dans les cellules U87MG par TUNEL. Un iodure de propidium (PI), contre-colorant a été utilisé. (E) Les effets de la chloroquine sur la membrane d'intégrité potentiel mitochondrial évalués par des mesures de l'accumulation mitochondriale fluorescent JC-1 dans les cellules de gliome avec wtp53 (U87MG) ou mutp53 (G112). Le rapport du rouge / verte de JC-1 a été déterminée par fluorescence dans les cellules non traitées ou traitées avec de la chloroquine pendant 24 ou 48 heures. Chloroquino conduit à la stabilisation de la protéine p53 et induit p53 cibles transcriptionnelles de gliome lignées cellulaires avec wtp53 La sensibilité accrue à la chloroquine dans des lignées de gliome exprimant wtp53 endogènes par rapport à des lignées cellulaires exprimant mutp53 (figures 1 et 2) a suggéré une implication de la voie p53 dans la cytotoxicité de la chloroquine. Par conséquent, nous avons évalué les niveaux de protéine p53 et de ses objectifs de la transcription dans les lignées cellulaires de gliome avec l'état fonctionnel de p53 connue par analyse par transfert de Western. Les résultats ont montré que le traitement à la chloroquine a entraîné une stabilisation marquée de la protéine p53, qui est la chloroquine dose-dépendante (Fig. 3 A, représentée par la ligne U87MG). La stabilisation induite par la chloroquine de la protéine p53 a été considérée comme fonctionnellement pertinente car elle a été accompagnée d'une augmentation de l'expression des gènes régulés par p53 (Fig. 3 B, panneau de gauche). Fait important, le p53 réponse transcriptionnelle de chloroquine activé est efficace non seulement dans l'induction de gènes impliqués dans la régulation de p53 et le contrôle du cycle cellulaire / réparation de l'ADN (mdm2 et p21), mais aussi des cibles apoptotiques de p53 (de PIG3 et bax). L'augmentation induite par la chloroquine dans les niveaux de gènes cibles p53 d'expression a également été observée dans d'autres lignées cellulaires exprimant wtp53 tels que HCT116 et G168 (fig. 3 B, panneau de droite et de données non représentées). En revanche, le traitement à la chloroquine n'a pas induit de gènes cibles de la p53 dans des lignées de gliome dépourvues de p53 fonctionnelle (fig. 3 C). Ces résultats démontrent que la chloroquine conduit à une augmentation du niveau de la protéine p53 et induit une réponse transcriptionnelle dépendante de p53 dans les cellules de gliome avec wtp53. Etant donné que l'activité de p53 est régulée principalement au niveau post-traductionnel 36, 37 et que la chloroquine ne modifie pas les niveaux de p53 transcription, 38 nous avons ensuite examiné la possibilité que la chloroquine peut induire des modifications p53 post-traductionnelles connus pour favoriser la stabilisation de p53 en réponse à différents types de cellules stress. En particulier, nous nous sommes intéressés à évaluer p53 phosphorylation à un résidu sérine en position 15 (p53-Ser15), une modification post-traductionnelle médiée par l'ATM / ATR kinases 39 et indispensables à la stabilisation de p53 dans les cellules réponse aux dommages de l'ADN. La voie p53 est sensible à la chloroquine. la protéine p53 et les produits de la cible connue p53 p21. mdm2. bax1. ou PIG3 ont été évaluées dans des lignées cellulaires de gliome ayant différents statuts de p53 (CA) et dans le carcinome du côlon HCT116 lignée cellulaire humaine exprimant wtp53 (B) par Western Blot. Les cellules ont été traitées avec des concentrations variant de chloroquine pendant 24 heures (A) ou avec une dose constante de la chloroquine (30 g / ml) pendant les périodes de temps indiquées (B et C). (D) Évaluation de l'état de phosphorylation de p53 à un résidu sérine Ser15 dans U87MG (panneau supérieur) et HCT116 (panneau du bas) des cellules traitées avec de la chloroquine ou de radiations ionisantes. La forme phosphorylée de p53 (p53-Ser15 P) a été détectée en utilisant un anticorps 16G8 de phosphorylation sensible, qui ne reconnaît que la p53 phosphorylée Ser15 P isoforme. la détection totale de p53 était par l'anticorps DO-7. La tubuline composant cytosquelette exprimé de manière ubiquitaire ou le facteur de transcription de base TBP a été évaluée pour assurer une charge égale en protéines. L'état de phosphorylation de p53-Ser15 a été évaluée dans les cellules U87MG traités par chloroquine ou par - irradiation. Comme prévu, - irradiation a induit une phosphorylation de p53 rapide Ser15, qui a précédé la stabilisation de la protéine p53 (Fig. 3 D, le panneau supérieur, comparer les niveaux de p53-Ser15 P avec le niveau total de p53 dans les voies 14). Ces résultats indiquent que les dommages à l'ADN dépendante de la signalisation convergeant p53 est intact dans les cellules U87MG. En revanche, la stabilisation de p53 après un traitement à la chloroquine, apparente déjà 6 heures après le traitement (Fig. 3 D, panneau supérieur, comparer les niveaux de p53 totale dans les voies 5 et 7), n'a pas été accompagnée par phosphorylation appréciable à p53-Ser15 par rapport aux niveaux de référence (comparer les niveaux de p53-Ser15 P avec le niveau total de p53 dans les voies 14 et 58). Cette absence de corrélation entre la stabilisation induite par la chloroquine, de p53 et de sa phosphorylation au niveau Ser15 a été observée non seulement dans les cellules de gliome, mais aussi dans le contexte cellulaire différent d'une lignée de cellules de carcinome HCT116 du côlon, un paradigme expérimental largement utilisé de la voie p53. 40 Conformément à la tendance observée dans les cellules de gliome, des cellules HCT116 répondent à la chloroquine par une stabilisation marquée de la protéine p53 et l'induction de gènes cibles p53 (Fig. 3d, panneau de droite). Par contraste avec la phosphorylation robuste et rapide de la p53-Ser15 induite par Rayonnement (fig. 3 D, panneau inférieur, comparer les niveaux de p53-Ser15 P dans les lignes 2, 5 et 8 avec les niveaux de base de p53-Ser15 P représentés dans le couloir 1), un traitement à la chloroquine n'a pas provoqué une augmentation considérable de la p53-Ser15 phosphorylation (comparer les niveaux de p53-Ser15 P dans les pistes 3, 6 et 9 avec les niveaux de p53-Ser15 P de base figurant dans le couloir 1). Ces observations suggèrent fortement que la stabilisation de p53 et l'activation de p53 réponse transcriptionnelle par chloroquine peut dépendre de mécanismes distincts de signalisation induite par des lésions de l'ADN. L'induction de l'apoptose par Chloroquine requis p53 Les conclusions que la chloroquine induit l'apoptose et active la voie p53 a soulevé la question d'un lien de causalité entre les deux phénomènes. Pour répondre à cette question, nous avons évalué les effets de la p53 knockdown sur l'efficacité de l'apoptose induite par la chloroquine. des lignées cellulaires de gliome ont été transfectées avec p53 disponibles dans le commerce ARNsi pour inhiber p53 endogène. Les cellules transfectées avec non spécifique siRNA (scr-siRNA) ont été utilisés comme témoin. L'inhibition de la p53 par des siRNA-p53 a été confirmée par coloration immunofluorescente pour la protéine p53 (Fig. 4 A) et par une analyse par transfert de Western (données non montrées). des lignées cellulaires de gliome transfectées avec l'ARNsi de p53 ou scr-siRNA ont été traitées avec de la chloroquine pendant 72 heures et évalués pour la caspase-3 activée. Marquer le taux de cellules apoptotiques, le pourcentage de cellules positives pour clivée a été déterminée de la caspase-3. Les résultats ont montré que l'inhibition de wtp53 par ARNsi de p53 conduit à une réduction significative du nombre de cellules positives à la caspase-3 activée dans U87MG. AEGFR traitées à la chloroquine et des cellules exprimant wtp53 G120 (P 0,012 et 0,0009, respectivement, Fig. 4 B). En revanche, l'inhibition de mutp53 dans la ligne G112 n'a eu aucun effet sur les taux d'apoptose induite par la chloroquine dans le p53-siRNA ou des cellules scr-siRNA-transfectées (Fig. 4 B). Ces résultats démontrent que la fonction wtp53 est essentielle pour l'induction de l'apoptose par la chloroquine. L'inhibition de p53 diminue la réponse apoptotique à la chloroquine dans des lignées cellulaires de gliome avec wtp53. (A) L'évaluation de l'efficacité de la p53 inhibition endogène par transfection avec scr-siRNA non spécifique ou p53-siRNA. cellules U251 qui expriment des niveaux élevés de mutp53 endogènes ont été transfectées avec scr-siRNA ou p53-siRNA et colorées avec l'anticorps DO-7 pour déterminer l'effet des siRNA. (B) l'inhibition de la p53 par des siRNA p53 a diminué de manière significative (P 0,02), l'activation de la caspase-3 dans les lignées cellulaires de gliome avec wtp53 mais pas dans les lignes mutp53. Le pourcentage de cellules avec la caspase-3 activée a été déterminée par comptage d'au moins 500 cellules dans 510 champs microscopiques à partir de trois lamelles couvre-répliquées. Les résultats indiqués représentent la moyenne de deux expériences. Chloroquine inhibe la croissance de gliome expérimental Nos résultats que la chloroquine induit la mort des cellules de gliome de culture nous a incité à examiner les effets de chloroquine dans un modèle de souris gliome orthotopique. 41 souris nues ont été intracrânienne implantés avec des cellules U87MG et randomisés à la chloroquine ou un traitement placebo. Dix jours après l'implantation (environ un tiers de la survie moyenne des souris U87MG implanté dans ce modèle de xénogreffe), un groupe a reçu une injection quotidienne de chloroquine intratumorale dans du PBS et du deuxième groupe on a administré du PBS seul. Vingt-six jours après l'implantation, les animaux ont été sacrifiés et les cerveaux porteurs de tumeurs ont été traitées pour l'histologie. Les mesures histomorphométriques ont montré une réduction significative de la taille moyenne de la tumeur dans le groupe de la chloroquine par rapport au groupe témoin (P 0,0068) (Fig. 5 A, panneau de gauche). tumeurs chloroquine traités ont montré un nombre significativement plus faible de cellules en mitose par rapport au groupe témoin (P 0,0018) (Fig. 5 A, panneau central et Fig. 5 B), alors que le nombre de cellules apoptotiques par TUNEL était significativement plus élevée chez chloroquine tumeurs traités par rapport au groupe traité par placebo (P 0,0019) (Fig. 5 A, panneau de droite et Fig. 5 C). Ces données confirment nos données in vitro et démontrent que la chloroquine est efficace dans la suppression de la croissance et induire l'apoptose de gliome expérimentale in vivo. Le traitement du gliome expérimental avec chloroquine in vivo. Les volumes des tumeurs et des indices mitotiques et apoptotiques ont été déterminés dans chloroquine ou traitées avec du STP tumeurs U87MG comme décrit dans la section Matériels et Méthodes. (A) Les tumeurs traitées Chloroquine montrent une diminution significative du volume moyen de la tumeur et un indice mitotique plus bas, mais des taux significativement plus élevés de cellules apoptotiques. L'analyse des données a été effectuée en utilisant une analyse unidirectionnelle de variance. (B) représentatifs hématoxyline / éosine teinté coupes histologiques. Les flèches indiquent les cellules en mitose. (C) représentant TUNEL-colorées des coupes histologiques. Les flèches indiquent les cellules TUNEL-positives. Discussion Cette étude démontre les effets du dérivé quinoléine de la chloroquine sur la croissance et la viabilité des cellules gliales en culture et sur le gliome expérimental chez la souris nude. Les résultats montrent que l'induction de l'apoptose médiée par p53 est l'un des mécanismes qui sous-tendent les effets de la suppression de la chloroquine sur la croissance. Bien qu'il y ait des preuves préliminaires et empirique que la chloroquine peut retarder la progression de gliome et améliorer les résultats chez les patients de glioblastome, 30 la base moléculaire des effets induits par la chloroquine dans les cellules de gliome restent mal caractérisés. Nous montrons que la chloroquine provoque une stabilisation durable de la protéine p53 et active la transcription de p53 dans la réponse des cellules de gliome. Ceci suggère que la voie p53 joue un rôle essentiel dans la suppression de la chloroquine à médiation de la croissance cellulaire et l'apoptose. L'appui de cette conclusion, la réponse apoptotique à la chloroquine est diminuée dans les cellules de gliome lorsque wtp53 est expérimentalement inhibée par p53-siRNA. Bien que le mécanisme précis par lequel la chloroquine actionne le bras de la réponse apoptotique de p53 doit être précisée, nos données suggèrent que p53-dépendante la transcription des gènes pro-apoptotiques induits en réponse à la chloroquine peut être impliquée. Une autre possibilité est que la chloroquine nonexcluding peut également favoriser une voie nontranscriptional à l'apoptose médiée par la fraction mitochondriale associée à la p53. 42 Celui-ci ne fait pas obstacle à une transcription p53-dépendante des gènes pro-apoptotiques par chloroquine. La fonction de suppresseur de tumeur de p53 dépend de sa capacité à agir comme facteur responsable du maintien d'un génome sans erreur ou comme un puissant inducteur de la mort cellulaire surveillance. La prévalence des activités survival - ou de décès de promotion de wtp53 semble dépendre du contexte cellulaire et le mécanisme d'action spécifique d'un facteur de stress particulier ou d'un médicament. Pour les traitements cytotoxiques induisant des dommages de l'ADN, un commutateur entre les activités survival - et l'apoptose promotion de p53 est pensé pour se produire lorsque l'étendue des dommages de l'ADN dépasse la capacité de réparation d'ADN de la cellule. De l'autre côté, une réparation réussie de lésions de l'ADN sert de signal de rétroaction pour rentrer dans le cycle cellulaire, ce qui nécessite la réduction de la protéine p53 à des niveaux de base. Parce que les cellules de gliome radiorésistantes sont équipés de mécanismes extrêmement efficaces de réparation de l'ADN et la capacité d'activer les dommages de l'ADN des points de contrôle, 43 un commutateur aux activités de la mort de promotion de p53 ne peut se produire à des doses qui peuvent être difficiles à réaliser dans le cadre de l'ADN cliniquement pertinente agents - damaging. Aucun déclaré.